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Tecnologie di supporto

Livelli di antibiotici nel corpo: un biosensore li rileva tramite il respiro

chip multiplex
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Scritto da Francesca Zangaro

Un team di ingegneri e biotecnologi dell’Università di Friburgo ha sviluppato un biosensore in grado di rilevare per la prima volta i livelli di antibiotici tramite il respiro. Il sensore è un chip multiplex, dotato di proteine sintetiche, in grado di riconoscere gli antibiotici e generare in risposta un cambiamento di corrente al suo interno. Il dispositivo in futuro potrà contribuire a dosare farmaci personalizzati contro malattie infettive e a ridurre la diffusione dell’antibiotico-resistenza.

Una nuova arma per combattere la resistenza agli antibiotici

Una delle più gravi minacce contemporanee per la salute pubblica è il fenomeno dell’antibiotico-resistenza. Dovuta all’uso inappropriato di antibiotici, l’antibiotico-resistenza porta i batteri a diventare resistenti ai principi attivi ai quali un tempo erano sensibili, rendendo più difficile il trattamento delle infezioni. Il mancato rispetto dei tempi e del dosaggio della terapia prescritta dal medico sono alla base di tale fenomeno.

Mantenere la concentrazione degli antibiotici nel corpo a livelli adeguati, secondo la propria terapia farmacologica, è di fondamentale importanza per ottenere l’effetto desiderato dal farmaco.

Il metodo di monitoraggio più comune è l’analisi del sangue, che tuttavia risulta poco pratico se si considerano i costi e le risorse associate alla raccolta e all’elaborazione dei campioni. La sfida diventa ancora più impegnativa a causa dei complessi meccanismi di trasporto degli antibiotici che, dal sangue al sito di campionamento di interesse, potrebbero complicare l’interazione tra antibiotici e attività metaboliche, richiedendo in questo modo metodi di rilevamento altamente sensibili. 

Tuttavia questa verità non si applica al sistema di trasporto sangue-respiro, che sembra essere relativamente più diretto rispetto ad altri. 

Il respiro potrebbe quindi rappresentare una potenziale alternativa per aggirare gli ostacoli nei meccanismi di trasporto del farmaco.

Ispirati da quest’idea, un gruppo di ricercatori dell’Università di Friburgo, guidato dai medici Can Dincer e H. Ceren Ates, ha sviluppato un sensore in grado di rilevare i livelli di antibiotici nel corpo umano tramite il respiro

Lo studio condotto dai ricercatori

L’esperimento è stato condotto su un gruppo di suini Landrance, a cui sono stati somministrati con diversi dosaggi due antibiotici appartenenti alla famiglia dei β-lattamici: piperacillina e tazobactam. Gli animali sono stati suddivisi in gruppi a seconda del dosaggio di antibiotici ricevuto: alto, basso o adeguato.

Per poter rilevare e monitorare i livelli di antibiotico, i ricercatori hanno raccolto campioni di plasma, urine, sangue, saliva e condensato del respiro esalato (o EBC, i.e., Exhaled Breath Condensate) (Figura 1).

dosaggio antibiotici chip respiro
Figura 1. L’esperimento prevedeva la somministrazione di tre diversi dosaggi di piperacillina/tazobactam e la raccolta di campioni di plasma, urine, sangue, saliva e condensato del respiro esalato. Credits: adapted from Advanced Materials

I ricercatori hanno analizzato i campioni utilizzando il biosensore microfluidico miLab. Il chip miLab è composto da una zona di rilevamento elettrochimico separata dall’area di immobilizzazione da una barriera di arresto idrofoba. Questa sua caratteristica consente sia di aggirare il problema dell’incrostazione degli elettrodi sia di operare con biofluidi complessi come il sangue (Figura 2).

Il biosensore ha la capacità di essere lo strumento cardine nelle misurazioni multianalita/campione, nella modellazione farmacocinetica/farmacodinamica (PK/PD) per individuare la terapia antibiotica e nella correlazione tra il sangue e gli altri campioni raccolti in maniera non invasiva (Figura 3).

biosensore microfluidico elettrochimico
Figura 2. Costituzione del biosensore microfluidico miLab.
Credits: Advanced Materials
potenzialità biosensore microfluidico misurazioni miLab
Figura 3. Potenzialità del biosensore. Credits: Advanced Materials

Design e meccanismo di funzionamento

Per produrre il biosensore microfluidico (miLab) è stata utilizzata la tecnologia dry film photoresist (DFR). Più strati di DFR sono stati disposti a pile su una pellicola di poliimmide. Sulla pellicola, oltre agli elettrodi di platino, sono stati realizzati dei canali microfluidici (Figura 4).

funzionamento biosensore multiplex celle elettrochimiche
Figura 4. a) Le tre diverse aree di incubazione del biosensore multiplex impilato. b) Le singole celle elettrochimiche e barriere di Teflon. Credits: Advanced Materials

Il campione contenente l’analita attraversa l’area di immobilizzazione mediante forze capillari in cui avviene il legame competitivo tra il β-lattame presente nel campione e il coniugato ampicillina-biotina con la proteina legante la penicillina. Questo legame competitivo provoca un cambiamento di concentrazione, che il sistema di trasduzione elettrica converte in un segnale misurabile.

Il segnale viene trasdotto rilevando amperometricamente il perossido di idrogeno, che viene generato nella cella elettrochimica utilizzando:

  • Un elettrodo di lavoro e controelettrodo in platino;
  • un elettrodo di riferimento argento/cloruro di argento.

Il segnale risulta inversamente proporzionale alla concentrazione di β-lattame nel campione.

Maggiore è la concentrazione di antibiotico presente nel campione, minore è il prodotto enzimatico che si sviluppa a seguito della reazione, e minore è la corrente misurata.

Si potrebbe dire che stiamo battendo i batteri al loro stesso gioco.

– W. Weber, professore di Biologia Sintetica e membro del team di ricerca

L’intero processo infatti, si basa su una proteina che, fissata sulla pellicola di poliimmide, è capace di riconoscere gli antibiotici β-lattamici. I batteri si servono di questa proteina per idrolizzare il β-lattame e inattivare di conseguenza l’antibiotico, impedendogli di svolgere la sua funzione.

Dopo ogni fase di incubazione, il microcanale viene lavato rispettando un adeguato protocollo di lavaggio; le biomolecole non legate vengono rimosse senza che la cella in cui avviene la misurazione venga contaminata.

I risultati dell’analisi EBC

La prima dimostrazione di successo dell’analisi EBC è data dai seguenti grafici rappresentanti la densità di corrente misurata in funzione del tempo: sia nel plasma che nell’EBC è stato osservato un comportamento di clearance simile, che consiste in una diminuzione improvvisa seguita da un andamento graduale di corrente (Figura 5).

densità corrente EBC dosaggio
Figura 5. Densità di corrente misurata in funzione del tempo per campioni di plasma ed EBC di animali sottoposti a sovradosaggio (grafici a sinistra), dose normale (grafici al centro) e sottodosaggio (grafici a destra) di piperacillina/tazobactam, a partire da prima della somministrazione dell’antibiotico (0), dopo 5 (BL), 30, 60, 120 e 180 min. Credits: Advanced Materials

Il tasso di variazione delle concentrazioni del farmaco nell’EBC ha mostrato un andamento quasi identico a quello riscontrato nel campione di saliva. Questa somiglianza potrebbe essere correlata al modo in cui si accede al mezzo di trasporto dell’antibiotico: gli antibiotici che passano dal flusso sanguigno alla saliva sono miscelati e diluiti all’interno dei dotti salivari in cui si accumulano secrezioni di varie ghiandole.

Quindi la concentrazione nella saliva risulta connessa al trasporto del farmaco in un dato momento e fornisce informazioni legate al tempo di permanenza del farmaco nei dotti salivari piuttosto che un feedback istantaneo. Questo processo naturale si riscontra anche nella procedura di raccolta dell’EBC, per la quale è previsto un tempo di circa 30 minuti.

capacità multicampione biosensore
Figura 6. La piperacillina/tazobactam possono essere analizzate in diversi tipi di campione. Credits: Advanced Materials

I ricercatori hanno anche dimostrato la capacità di misurazione multicampione della tecnologia, valutando simultaneamente quattro diversi tipi di campione sullo stesso chip (Figura 6).

I campioni di plasma, EBS e saliva sono stati analizzati per primi, 60 minuti dopo la somministrazione dell’antibiotico; mentre i campioni di urina sono stati raccolti 180 minuti dopo la stessa somministrazione.

Dal grafico si può osservare come per ogni campione vi sia una netta diminuzione della densità di corrente dopo 60/180 minuti, indice della reale presenza del farmaco e della capacità di misurazione multicampione del biosensore.

Riassumendo, il sensore è in grado di fornire le seguenti prestazioni:

  • Una soluzione rapida e a basso costo per quantificare l’antibiotico β-lattamico, con una capacità di ottenere il risultato in meno di 90 minuti;
  • Informazioni dirette sulla concentrazione di antibiotico senza alcun pretrattamento del campione;
  • La possibilità di analizzare simultaneamente diversi campioni senza compromettere la semplicità di funzionamento del chip.

Prospettive future

L’attuale studio pone le basi per i lavori futuri del team, come l’estensione del sensore indossabile cartaceo, che potrà essere integrato su qualsiasi tipo di maschera facciale per la misurazione continua e in tempo reale di antibiotici ß-lattamici, tramite l’espirazione. In futuro, saranno condotti studi clinici con il coinvolgimento di soggetti umani, per l’effettiva convalida del biosensore.

Il monitoraggio rapido dei livelli di antibiotici potrebbe diventare un enorme vantaggio se applicato in ospedale

– H. Ceren Ates, Università di Friburgo

Fonti e approfondimenti:
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Informazioni autore

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Francesca Zangaro

Studentessa di Ingegneria Biomedica, Università di Pisa.
Appassionata di innovazione e tecnologia con l’obiettivo di studiare e contribuire alla divulgazione di nuovi orizzonti scientifici nel campo dell’ingegneria biomedica.

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