Lenti a contatto bioelettroniche contro la depressione

I dispositivi elettronici indossabili stanno vedendo un’applicazione sempre più ampia presentandosi come valide piattaforme per la misurazione di segnali biologici. L’aspetto più interessante dietro a questi dispositivi potrebbe essere la capacità di andare oltre l’analisi metabolica o delle patologie locali. Infatti, è proprio in questa ottica che si presenta uno studio sudcoreano sullo sviluppo di lenti a contatto indossabili, soffici, che assicurano una stimolazione elettrica transcorneale basata su interferenza temporale (TI-TES). L’obiettivo è quello di investigare il trattamento di disordini mentali, quale la depressione, sfruttando l’occhio come via di accesso indiretta per la modulazione nervosa.

Disordine depressivo e attuali trattamenti clinici

Circa 332 milioni di persone nel mondo hanno un disordine depressivo¹. In accordo allo stato della patologia, le terapie² attuate sono:

• Trattamento psicoterapeutico: supporto nello stato depressivo lieve tramite sedute frequenti con un professionista;
• Trattamento farmacologico: applicato a partire dallo stato moderato/grave; i farmaci usati sono antidepressivi (e.g., fluoxetina, un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina);

Quando questi trattamenti non risultano avere alcuna efficacia, si procede con altre terapie che stimolano direttamente le cellule nervose per il rilascio di neurotrasmettitori coinvolti nella modulazione dell’umore (e.g., serotonina). Tra queste:

• Stimolazione magnetica transcranica: si pone una bobina magnetica in prossimità dell’area del cervello da stimolare;
• Stimolazione del nervo vago: si stimola il nervo vago grazie ad un dispositivo impiantato sotto la clavicola sinistra;
• Stimolazione cerebrale profonda: si impiantano elettrodi di stimolazione nelle zone del cervello che interessano la regolazione dell’umore e le risposte biologiche.

La principale sfida di queste tecnologie è un compromesso da scegliere tra profondità di stimolazione e invasività. Da un lato, raggiungere le strutture profonde del cervello coinvolte nella depressione (come l’ippocampo) richiede interventi chirurgici estremamente invasivi. Dall’altro lato, le terapie che non prevedono un impianto, come la stimolazione magnetica transcranica, si limitano solo alla corteccia superficiale.

Il lavoro del gruppo di ricerca sudcoreano mira proprio a risolvere questo trade-off: sfruttare l’anatomia per garantire una terapia minimamente invasiva e capace di raggiungere le stesse strutture profonde.

Lenti a contatto come dispositivi elettrici applicabili

Compliance delle lenti a contatto: i materiali usati

Per poter assicurare tanto l’aderenza alla superficie corneale quanto la modulazione nervosa, le lenti a contatto devono integrare una struttura a serpentina interconnessa ad elettrodi di stimolazione localizzati. La serpentina, infatti, assicura uno stiramento meccanico mantenendo integra la struttura anche sotto deformazione. Dall’altro lato, gli elettrodi sono stati realizzati seguendo una struttura multistrato (Figura 1):  

• Si stampa il primo strato (3 nm) realizzato con ossido di gallio (GaOx). Tale materiale assicura non solo buone proprietà ottiche in termini di trasparenza, ma anche buone proprietà elettriche in termini di conducibilità;
• Si deposita a vuoto il secondo strato (1 nm) realizzato con platino (Pt);
• Si aggiunge  un’ulteriore decorazione di nanoclusters di Pt (PtB) solo in corrispondenza degli elettrodi di stimolazione. I nanoclusters aumentano la superficie specifica che assicura una riduzione dell’impedenza elettrica all’interfaccia tra elettrodo e tessuto. Questo è necessario per favorire una conversione efficace della corrente elettrica in flusso ionico nel tessuto.

Gli elettrodi poi vengono integrati con le lenti a contatto grazie a un processo a stampo (molding). Questo preserva tanto le proprietà meccaniche delle lenti a contatto quanto quelle ottiche: non è stata misurata alcuna deformazione e i cambiamenti nella trasparenza sono stati minimi.

TI-TES: come viene assicurata la stimolazione elettrica transcorneale

La comunicazione nel sistema nervoso unisce tanto segnali di natura elettrica che chimica. All’interno di un neurone si ha la generazione di un segnale elettrico, mentre l’interazione tra due cellule nervose si basa sul rilascio di messaggeri chimici come i neurotrasmettitori.

Quando un neurotrasmettitore viene rilasciato da un neurone, si lega ai canali ligando-dipendenti presenti a livello dei dendriti e del soma della successiva cellula nervosa. Il legame con questi permette la loro apertura con conseguente passaggio di specie ioniche (K+, Na+, Cl-) attraverso la membrana. Questo flusso ionico altera il potenziale di membrana (i.e., differenza tra la carica interna ed esterna alla membrana cellulare) e se questa raggiunge una determinata soglia all’axon hillock (i.e., parte iniziale dell’assone) si genera un potenziale di azione. Il potenziale di azione è un meccanismo “tutto-o-nulla”: si innesca solo col superamento del valore soglia ed è autosostenuto dalla apertura dei canali voltaggio-dipendenti del sodio localizzati lungo l’assone. Arrivato nella zona terminale del neurone, il potenziale di azione permette l’apertura di canali voltaggio-dipendenti del calcio Ca²⁺: l’ingresso di questi ioni assicura infine il rilascio dei neurotrasmettitori al neurone successivo (Figura 2).

Per poter garantire la variazione del potenziale di membrana, i ricercatori hanno sfruttato due coppie di elettrodi posti sulla superficie corneale (Figura 3) e il meccanismo di interferenza temporale. Ciascuna coppia genera un campo elettrico a una frequenza superiore ad 1 KHz (e.g., 2000 Hz e 2020 Hz). Tale frequenza è troppo elevata per i neuroni superficiali e non genera alcuna modulazione del potenziale di azione.

Tuttavia, l’interazione tra questi due campi permette la creazione di un inviluppo a bassa frequenza (e.g., 20 Hz) in corrispondenza della retina, capace di innescare il potenziale di azione nelle cellule ganglionari retiniche (RGCs) e nelle cellule ganglionari intrinsecamente fotosensibili (ipRGCs). Il segnale raggiunge così l’ampiezza picco-picco (i.e., differenza tra valore massimo e valore minimo di ampiezza) uguale a 200 mV mentre nelle regioni periferiche si ha una graduale diminuzione dell’ampiezza di inviluppo (Figura 3). Il metodo di interferenza temporale, a differenza del metodo tradizionale che sfrutta solo la stimolazione a bassa frequenza, assicura un’attivazione localizzata della regione profonda della retina, tralasciando le regioni circostanti oculari.

Valutazione terapeutica della TI-TES

Per valutare la risposta a seguito della stimolazione, i ricercatori hanno scelto i topi rd1 che esibiscono una degenerazione dei fotorecettori (i.e., coni e bastoncelli). La scelta, difatti, non è casuale: il gruppo di ricercatori ha voluto attribuire i benefici ottenuti dall’attivazione dei neuroni retinici tramite TI-TES (i.e., stimolazione elettrica transcorneale basata su interferenza temporale), escludendo l’influenza di stimoli ambientali e di percezioni visive.

La valutazione si esegue su tre gruppi: gruppo di controllo simulato (sham group), gruppo con depressione indotta da corticosterone (Dep group) e gruppo con depressione trattata con TI-TES (TES group). Successivamente, i ricercatori hanno eseguito prima una ottimizzazione dei parametri della stimolazione (i.e., frequenza dei segnali di inviluppo, ampiezza picco-picco, tempo e durata di stimolazione), e valutato poi la risposta comportamentale. I test eseguiti sono stati i seguenti:

• Test del campo aperto (Open-Field Test, OFT)
• Test della sospensione per la coda (Tail-Suspension Test, TST);
• Test del nuoto forzato (Forced Swim Test, FST);
• Test del comportamento sociale (Social Behavioral Test): test della novità sociale e test delle tre camere.

Per l’ottimizzazione dei parametri, il test del campo aperto (OFT) risulta essere il migliore perché assicura un risultato continuo e un’influenza minima da fattori quali stress, apprendimento e fatica. A valle di misurazioni ripetute, il risultato maggiore dell’OFT, in termini di tempo speso dai topi nella zona centrale, è stato ottenuto ad una frequenza di inviluppo di 20 Hz, ampiezza picco-picco di 200 mV, stimolazione di 30 minuti per 3 giorni. 

Analisi comportamentale

Nel test del campo aperto, il gruppo con depressione mostra una ridotta attività motoria e alta propensione ad allontanarsi dalla zona centrale. Invece, il gruppo TES ha mostrato un incremento della distanza percorsa, e dunque dell’attività motoria, così come un aumento della permanenza nella zona centrale. Dalla Figura 4, infatti, è possibile notare come il risultato TES ricalchi quanto ottenuto dal gruppo Sham.

Analogamente, anche i test della sospensione della coda e del nuoto forzato, volti a misurare la capacità di reazione ad una situazione di stress, mostrano un decremento di circa del 50% dell’immobilità rispetto al risultato del gruppo Dep. Infine, anche dal test delle tre camere si osserva una inversione dell’andamento depressivo: il gruppo trattato dalla stimolazione è più propenso alla socializzazione alla novità sociale rispetto al gruppo con depressione. Anche in questo, si osservano dei risultati comparabili col gruppo di controllo.

Gli stessi test sono stati svolti sui topi C57BL/6 – che invece non presentano alcuna degenerazione dei fotorecettori. I risultati ottenuti sono stati analoghi ai precedenti: di conseguenza, gli effetti antidepressivi assicurati dalla TI-TES non dipendono dalla degenerazione retinale.

Infine, i ricercatori hanno valutato la risposta del gruppo Dep trattato dal farmaco fluoxetina, un inibitore che limita il riassorbimento della serotonina, aumentandone la disponibilità ai neuroni a valle. I risultati ottenuti dall’OFT mostrano degli andamenti analoghi a quelli ottenuti tramite semplice TI-TES. Ancora una volta, la TES si presenta come una promettente terapia antidepressiva.

Analisi strutturale del tessuto oculare

Per valutare l’integrità del tessuto oculare, invece, sono stati scelti i topi C57BL/6, data la loro normale anatomia retinale. I topi poi sono stati divisi in due gruppi di controllo: TI-TES on, gruppo sottoposto a stimolazione di 30 minuti al giorno per 3 settimane, e TI-TES off, gruppo di controllo.

Dall’analisi istologica si nota che lo spessore della cornea non differisce tra i due gruppi, TES on e TES off (Figura 5). Inoltre, dall’immunofluorescenza condotta su due biomarcatori specifici – TUNEL per rilevare la frammentazione del DNA cellulare e CD45 come indicatore di infiltrazione infiammatoria – emerge che la stimolazione non induce alcun incremento nei processi apoptotici e infiammatori. Pertanto, la stimolazione TI-TES è ampiamente biocompatibile e sicura, perché capace di mantenere sia l’integrità fisica che biologica della struttura corneale.

Medesime valutazioni poi sono state condotte sulla regione retinale: dall’analisi istologica non emerge alcuna variazione nello spessore della retina (Figura 6) così come l’analisi di immunofluorescenza – applicata su TUNEL e su Iba1, marcatore delle cellule microgliali – non rileva morte cellulare e incremento dei processi di infiammazione. Pertanto, anche per la parte più profonda del tessuto oculare, la stimolazione TI-TES non induce danni strutturali, apoptosi o processi infiammatori, risultando biologicamente valida per applicazioni a lungo termine.

Validazione dell’efficacia del TI-TES: un approccio basato sul machine-learning

Infine, per poter validare l’efficacia terapeutica del trattamento, il gruppo di ricerca ha implementato una metodologia basata sul machine-learning, sfruttando l’algoritmo di classificazione macchina a vettori di supporto (i.e., SVM, support vector machine).

Approfondimento sull’algoritmo SVM

Il SVM è un algoritmo di machine learning supervisionato, addestrato dunque su dati già etichettati per risolvere problemi di classificazione. L’obiettivo è trovare l’iperpiano di separazione ottimale tra i dati delle classi massimizzando la distanza tra i punti più vicini, detti vettori di supporto. Tale distanza assicura un margine di sicurezza per generalizzare la catalogazione su dati nuovi.⁷ (Figura A1)

La dimensione dell’iperpiano dipende dal numero delle caratteristiche date in pasto all’algoritmo: ad esempio, qualora siano solo due, i dati vivrebbero in uno spazio bidimensionale e la separazione è dettata da una semplice linea. Il numero di iperpiani, invece, è guidato dal numero di classi. In questo caso, il gruppo di ricercatori ha raccolto i dati comportamentali, i segnali nervosi e, infine, quelli biologici per la classificazione in tre gruppi (sham, Dep e TES, ciascuna dei tre con un numero di campioni uguale a 10).

Per valutare la prestazione dell’algoritmo, è stata usata come metrica la matrice di confusione (Figura 7): una griglia che mette a confronto le classi predette (asse orizzontale,, con quelle reali (asse verticale) per visualizzare le previsioni corrette ed errate⁸. Come evidenziato dai valori percentuali lungo la diagonale, l’algoritmo mostra un’alta accuratezza.

Infine, per poter validare ulteriormente questo risultato hanno calcolato la distanza euclidea tra il gruppo TES e gruppo sham e tra il gruppo TES e gruppo Dep. Come si osserva dalla Figura 8, i dati appartenenti al gruppo TES risultano essere molto più vicini a quelli del gruppo sham, mentre quelli del gruppo DEP si collocano ad una distanza superiore, sul lato opposto dell’iperpiano.

Pertanto, come riscontrato già dalle analisi comportamentali, la TI-TES potrebbe diventare una modalità di neuromodulazione non-invasiva capace di invertire i tratti comportamentali, biologici e nervosi tipici dello stato depressivo.

Conclusioni

Dalle valutazioni comportamentali, supportate dall’algoritmo di machine-learning, si comprende come la stimolazione transcorneale potrebbe diventare una valida terapia nel trattamento di disturbi psichici, tra cui la depressione. Nonostante i promettenti risultati, tuttavia, bisogna comprendere quali sono le sfide per traslare questa terapia in ambito clinico.

Prima di tutto, l’uso umano a lungo termine richiederà un controllo wireless. Questo è necessario per garantire il controllo della stimolazione e il monitoraggio delle condizioni di sicurezza in tempo reale. Inoltre, bisogna valutare anche l’intrinseca variabilità dell’anatomia oculare, della curvatura corneale così come del film lacrimale e implementare, pertanto, una terapia personalizzata. Infine, l’uso prolungato di tali dispositivi richiederà ulteriori valutazioni sulla salute della superficie oculare, sugli stati infiammatori così come della biocompatibilità.

Tuttavia, la TI-TES apre un ampio spettro di possibilità applicative: 1) comprendere quali vie retiniche e tipi cellulari rispondano meglio così da estendere il trattamento ad altre patologie neurologiche, 2) indagare i processi di neuromodulazione di base persino in soggetti sani, e 3) permettere una comparazione nella risposta tra individui migliorando lo studio dello spettro di potenza delle onde cerebrali (i.e., delta, theta, alpha, beta, gamma).

1. Depressive disorder (depression) ↩︎
2. Depressione – Disturbi di salute mentale – Manuale MSD, versione per i pazienti ↩︎
3. Open Field Test – an overview | ScienceDirect Topics ↩︎
4. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice | Psychopharmacology | Springer Nature Link ↩︎
5. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity | Psychopharmacology | Springer Nature Link ↩︎
6. Gabbia per sperimentazione animale per roditori – Noldus – modulare ↩︎
7. Cos’è una macchina a vettori di supporto? | IBM ↩︎
8. Che cos’è una matrice di confusione? | IBM ↩︎