Aumenta di anno in anno la richiesta del mondo della ricerca scientifica di avere a disposizione grandi quantità di campioni biologici da studiare. Naturalmente questi campioni, destinati a studi diagnostici e farmacologici, devono provenire da strutture qualificate e certificate: le biobanche. Una gestione ottimale di queste ultime prevede non solo l’adeguata conservazione del campione biologico, ma anche la creazione di un robusto sistema di tracciabilità ad esso relativo. Tra i materiali biologici oggetto della raccolta vi sono le cellule staminali, considerate le armi dell’ingegneria tissutale, dotate di un grande potere terapeutico. Anche se i risultati delle ricerche sull’impiego di questo tipo di cellule fanno ben sperare in una futura riduzione delle attuali pratiche di chirurgia invasiva, c’è da porre ancora molta attenzione nello standardizzare questa metodica per uso diffuso.
Perché inserire le biobanche nello scenario della medicina personalizzata?
Il continuo progresso tecnologico e le metodologie sempre più avanzate di diagnosi hanno aperto la strada ad una nuova prospettiva di cura: la medicina personalizzata. Come il nome lascia intendere, questo nuovo modello di cura richiede, di base, che venga fornita “la cura giusta al paziente giusto al tempo giusto”. Tale concetto si basa sul fatto che ogni individuo è differente e molte tipologie di malattie evolvono in modo e in tempi diversi a seconda del soggetto, per cui per ogni paziente bisogna trovare la terapia adeguata.
Come ha affermato il professore ordinario di Anatomia patologica presso l’Università di Perugia, Angelo Sidoni, ciò deriva dal fatto che la medicina personalizzata è una diretta conseguenza del sequenziamento del genoma. Questa avanzata metodica di indagine biotecnologica ha, di fatto, sdoganato un concetto innovativo: le malattie sono l’espressione fenotipica dell’azione di centinaia o migliaia di geni che si sono ammalati.
Circa 20 anni fa, infatti, con le prime ricerche sul sequenziamento del genoma umano, si sono gettate le basi per dimostrare che tutte le malattie cambiano da paziente a paziente. Da qui deriva la necessità di classificare per ogni caso, un profilo di tipo prognostico e predittivo.
In questo scenario, la possibilità di conservare campioni biologici, relativi a miliardi di individui, a scopo di ricerca, rappresenta quello che sembra essere il mezzo fondamentale per raggiungere, in tempi relativamente veloci, tale risultato e predisporre sia i test diagnostici in grado di identificare l’insorgere della malattia che i farmaci bersaglio.
Le strutture qualificate che garantiscono la conservazione dei campioni biologici sono proprio le biobanche.
Nel 2009 un articolo del Time Magazine le annoverava tra le dieci idee che avrebbero rivoluzionato il mondo moderno. Lo stesso articolo le considerava un “conto bancario biologico”. Possono essere deposti in tali strutture:
- frammenti di tessuto solido asportati durante interventi chirurgici;
- campioni provenienti da materiale donato per trapianto e non utilizzato;
- sangue, urine o altri liquidi biologici;
- campioni citologici.
Tali materiali guadagnano interesse medico sotto forma di conoscenza e di terapie derivanti dall’analisi di ciò che viene adeguatamente conservato e reso accessibile, in conformità alle norme vigenti sulla privacy.
Come funziona una biobanca: strumentazioni e tecnologie
La biobanca è una struttura estremamente complessa da gestire in maniera interdisciplinare: la sua funzionalità può essere considerata appieno solo se è possibile dotarla di personale e strumenti.
Tutti i campioni che entrano nella biobanca devono essere codificati in maniera univoca secondo uno schema concordato all’atto di fondazione della biobanca. Un esempio di possibile etichettatura associata al contenitore destinato al campione è il seguente:
Banca/anno/Protocollo di studio/Numero progressivo del paziente/lettere per identificare il campione
Ciascun contenitore deve essere etichettato utilizzando materiale resistente alle basse temperature che sono quelle a cui viene conservato il materiale biologico.
Si tratta di temperature sufficientemente basse per bloccare gli enzimi degradativi: il DNA si conserva bene a temperature dai -20°C ai -70°C; altri campioni, come le cellule vive, devono essere conservati a temperature prossime ai -200°C . La raccolta dei campioni avviene in stanze completamente spoglie, le tank room, che dispongono di sistemi di criogenia i quali garantiranno la crioconservazione. Il processo di raffreddamento deve essere più rapido possibile per evitare la formazione di grossi cristalli di ghiaccio, capaci di alterare profondamente la struttura delle cellule.
Il congelamento può essere ottenuto mediante isopentano preraffreddato con azoto liquido o direttamente in azoto. Nel primo caso, si inserisce l’isopentano in un recipiente e lo si raffredda immettendolo nell’azoto liquido. Dopodiché il campione è posto su un supporto metallico da immergere, con delle opportune pinze, nell’isopentano freddo per circa 30 secondi. Infine, esso è direttamente immesso nell’azoto liquido e conservato a -80 °C.
Il secondo metodo di congelamento, più semplice, consiste nell’immersione diretta del campione in un recipiente contenente azoto liquido, un fluido criogenico. L’utilizzo di azoto liquido da solo può generare un problema che coinvolge la procedura di congelamento di alcuni tipi di tessuto, come i tessuti muscolari: la formazione di una barriera di gas azoto vicino al tessuto, che funge da isolante e inibisce il raffreddamento del campione-tessuto. Pertanto è necessario praticare 14 fori nella parete del contenitore del campione (cryovial): quando l’azoto liquido fluisce attraverso i fori del contenitore, la velocità di flusso attorno il tessuto è abbastanza elevata da eliminare la barriera di gas.
Nella Biobanca, inoltre, è necessario disporre di sistemi per la criopreservazione, da non confondere con quelli di criogenia precedentemente esaminati. Mentre questi ultimi producono e utilizzano temperature molto basse, i primi realizzano processi di laboratorio attraverso cui cellule e tessuti possono essere conservati a bassissime temperature – generalmente a -196°C (punto di ebollizione dell’azoto liquido) – senza subire alterazioni nella loro struttura. Sono i crioprotettori a garantire maggiore grado di sopravvivenza cellulare durante la procedura di congelamento. I crioprotettori convenzionali sono i glicoli: vengono aggiunti al mezzo di congelamento, riuscendo ad evitare lesioni cellulari e formazione di cristalli di ghiaccio che potrebbero alterare la permeabilità della membrana, danneggiare organelli cellulari o addirittura provocare la morte cellulare.
I sistemi per la criopreservazione possono essere implementati utilizzando sia apparecchiature elettriche, come freezer, che contenitori per azoto liquido in cui allocare le scatole contenenti i campioni biologici. Le capacità di stoccaggio di un freezer o di un contenitore per azoto sono variabili a seconda delle dimensioni degli strumenti e del volume dei contenitori in cui sono conservati i singoli campioni: per fiale da 2 ml le capacità possono variare all’incirca da 10.000 a 35.000 fiale.
Nel complesso di una biobanca può essere inserita una stazione per l’allestimento di tissue microarray, blocchi in paraffina che ospitano prelievi di tessuto.
Attraverso la tecnica dei TMAs (Tissue Microarrays), un ago cavo seleziona e rimuove una piccolissima sezione del tessuto di interesse (generalmente dal diametro di 0,6 mm). Dopodiché il tissue “core” viene inserito in un recipiente di paraffina in maniera ordinata e periodica per formare un pattern di array che può comprendere dalle 100 alle 500 unità di tessuti provenienti da diversi individui. Le sezioni derivanti da questo blocco sono successivamente sezionate mediante un microtomo, montate su un vetrino e analizzate.
Questa tecnica è privilegiata in diversi studi di coorte dove la popolazione è costituita da pazienti malati di cancro: la possibilità di avere a che fare contemporaneamente con un numero elevato di prelievi rappresentativi di masse tumorali, associati ad un enorme database clinico, consente al ricercatore di correlare al meglio patterns di espressione proteica e parametri clinici legati alla malattia.
In conclusione, è fondamentale che la biobanca sia dotata di supporti informatici che garantiscano l’archiviazione dei dati e l’interfacciamento con i sistemi digitali. Combinando tutte le informazioni che provengono da una biopsia, emergono migliaia di dati informativi che sono veri e propri big data che racchiudono, su larga scala, informazioni circa le caratteristiche dei pazienti, malattie, aspetti ambientali, stile di vita.
Cellule staminali: un ingente tesoro conservato nelle biobanche
La ricerca medica negli ultimi decenni sta compiendo grandi passi grazie al recente sviluppo di una nuova scienza: l’ingegneria tissutale. Essa ha lo scopo di riparare i tessuti e gli organi deteriorati da malattie, traumi o invecchiamento e quindi di ripristinare le loro funzioni perse. Tutto ciò avviene senza servirsi di protesi o tecniche di trapianto, ma grazie alla semina di cellule staminali su adeguati supporti tridimensionali definiti scaffold e in presenza di specifici fattori di crescita, le proteine segnale.
Le cellule staminali sono ritenute le armi dell’ingegneria tissutale e vengono conservate nelle biobanche perché si prevede che in futuro saranno un elemento di cura contro i tumori, utili nella terapia genica e tissutale nel trattamento di patologie ereditarie. Ad oggi, vengono utilizzate fondamentalmente nel trapianto del midollo osseo.
Essendo le cellule staminali le progenitrici di tutti gli organi e tessuti che non hanno ancora sviluppato una determinata funzione, se sottoposte a condizioni stabilite, possono orientarsi per formare strutture stratificate e costituire uno specifico tessuto o organo. Questo anche grazie alle loro caratteristiche peculiari di autorinnovamento e pluripotenza.
Le tecniche utilizzate nell’ingegneria tissutale seguono due vie differenti:
a) in vitro: fa parte di questa categoria la pelle “coltivata”, per il trattamento di pazienti affetti da gravi ustioni. La progettazione e la crescita del tessuto artificiale avviene al di fuori del corpo e poi viene impiantato sul tessuto danneggiato;
b) in vivo: le cellule vengono isolate dall’ambiente biologico naturale, seminate su scaffold e infine si esegue l’impianto di questo sistema nel corpo del paziente. Durante la produzione della matrice extracellulare da parte delle cellule, lo scaffold tende a biodegradarsi e viene progressivamente sostituito dal tessuto biologico rigenerato.
La tipologia del supporto influenza in maniera determinante i prodotti di secrezione delle cellule impiantate con conseguenti effetti sulla formazione del tessuto. Negli ultimi due decenni, il concetto di guida cellulare da associare allo scaffold ha determinato lo sviluppo di nuovi tipi di materiali sempre più propensi a realizzare una buona interazione con le cellule. Tra questi vi sono i cosiddetti materiali ibridi che hanno mostrato un’elevata biocompatibilità. Con tale termine si intende la capacità del materiale di indurre una risposta biologica in grado di favorire il recupero funzionale del tessuto nella sede dell’impianto, senza interferire con i meccanismi di rigenerazione tessutale o produrre reazioni infiammatorie o immunitarie avverse.
Ogni volta che nel corpo umano si verifica la rigenerazione dei tessuti, ad esempio in risposta a condizioni fisiologiche o ad un trauma, essa è il risultato di una complessa cascata di eventi, ciascuno dei quali è governato da segnali biofisici e biochimici. A loro volta, questi segnali sono attivati dal microambiente extracellulare, il mezzo di coltura naturale nel quale le cellule proliferano, si differenziano e migrano. Pertanto, il risultato finale della vita cellulare per la maggior parte del tessuto connettivo dipende dall’interazione dinamica e reciproca tra la cellula e la matrice extracellulare (ECM): le cellule sintetizzano, assemblano e degradano i componenti della ECM in risposta a specifici segnali e, dall’altra parte, la ECM, grazie alle sue caratteristiche strutturali, controlla e guida funzioni cellulari specifiche come la differenziazione.
Per imitare le caratteristiche topologiche e microstrutturali dell’ECM, uno scaffold deve presentare:
- alto grado di porosità che varia in relazione all’applicazione di interesse;
- elevato rapporto superficie/volume;
- alto grado di interconnessione dei pori;
- dimensione appropriata dei pori (la dimensione dei pori ottimale per i tessuti duri, ad esempio, si aggira intorno ai 100-400 µm).
Al momento attuale, le evidenze cliniche per un uso routinario di scaffold associati a cellule staminali e fattori di crescita sono ancora numericamente scarse, anche se decisamente convincenti.
Le biobanche nel futuro: pensare in grande
Le Biobanche possono essere viste come vere e proprie istituzioni visionarie: campioni di alta qualità e ricchi di dati sono essenziali per la ricerca futura. Negli ultimi 20 anni la scienza delle biobanche è diventata parte integrante della medicina personalizzata e un gran numero di biobanche è stato istituito in tutto il mondo per supportare lo sviluppo nella previsione, prevenzione, diagnosi e trattamento delle malattie.
Nonostante i progressi, le biobanche devono ancora affrontare molte questioni: mancanza di standard, di un vocabolario concordato, esigenza di avere a che fare con migliori pratiche per la raccolta di dati e l’elaborazione dei campioni.
Inoltre, la maggior parte dei cittadini europei non ha mai sentito parlare di biobanche né è a conoscenza della loro importanza nella ricerca. Un’informazione completa e imparziale sull’importanza del ruolo che rivestono le biobanche può aiutare molte famiglie a prendere una decisione consapevole affinché, ad esempio, venga sfruttato il potere terapeutico delle cellule staminali e affinché non venga sprecato questo grande patrimonio biologico.
Tuttavia sono varie le prospettive future intraviste per l’accreditamento delle biobanche nella ricerca, e molte di esse sono già in atto. Come ha rilasciato in un’intervista Elena Bravo, ricercatrice senior presso l’ISS, esse sono:
- un impatto diretto in diversi settori, dalla robotica alla bioingegneria, che coinvolgono materiale biologico;
- opportunità di collaborazione con ISO/TC che si occupano, ad esempio, di dispositivi diagnostici per laboratori medici, oppure di sicurezza alimentare;
- gestione dell’emergenza COVID-19. E’ prioritario, infatti, strutturare un modello di conservazione e distribuzione, tramite biobanche, dei campioni relativi al SARS-CoV-2 secondo standard uniformi. A Milano è già presente una banca biologica di Covid-19 che si sta rilevando un bene prezioso per lo studio e lo sviluppo di strategie diagnostiche e terapeutiche.
La ricercatrice ha inoltre aggiunto che altre prospettive intraviste per l’accreditamento delle biobanche sono legate alla valorizzazione dei modelli preclinici umani e veterinari per lo studio di meccanismi di patogenesi e di terapia. Non vanno infine dimenticati i campioni microbiologici, il cui utilizzo come agenti fermentanti e, più di recente, per lo sviluppo della bioingegneria, accompagna lo sviluppo della nostra società fin da tempi antichissimi.
Fonti e approfondimenti
- Springer EPMA Journal – Biobanks in the era of personalized medicine: objectives, challenges, and innovation
- Università degli Studi di Pavia – Creazione di una Biobanca ad elevati standard tecnologici per indagini biomolecolari nell’ambito della ricerca medico-scientifica
- Tissuebank – Biobanca: strumentazioni, personale e analisi dei costi
- Nature – Building better biobanks
- JoVe Journal – A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen
- Università degli studi di Cagliari – Applicazioni innovative dell’ingegneria biomedica
- ENEA – La fabbrica dei tessuti umani: il futuro bussa alle porte
- Biomaterials – A multi-functional scaffold for tissue regeneration: the need to engineer a tissue analogue
- Accredia – Biobanche, l’accreditamento per la ricerca e lo sviluppo
