Un nuovo dispositivo microfluidico indossabile per la raccolta e l’analisi colorimetrica del sudore

I ricercatori della Northwestern University, guidati da John A. Rogers, hanno pubblicato i risultati di test condotti su di un dispositivo microfluidico indossabile ed estremamente flessibile, progettato per la raccolta e l’analisi chimica del sudore, che integra sistemi elettronici di comunicazione wireless direttamente a contatto con la pelle. Le tecniche di monitoraggio della salute basate sull’analisi quantitativa del sudore potrebbero integrare gli approcci attuali, basati solo sulla valutazione sporadica di campioni di sangue, o potenzialmente sostituirli del tutto.

L’analisi del sudore in biomedicina ha una notevole importanza, ma spesso l’interpretazione delle informazioni ricavate dal sudore può risultare difficile a causa di incertezze dovute alla presenza di altri fluidi biologici, come il liquido interstiziale e il sangue, o per la mancanza di apparecchiature biomediche specifiche per il campionamento diretto e l’individuazione di biomarcatori multipli.

Questo nuovo dispositivo assicura una raccolta selettiva e non invasiva del sudore, offrendo la possibilità di condurre analisi biochimiche quantitative su alcuni importanti biomarcatori in esso contenuti, tra cui diverse proteine, ma anche elettroliti ed alcune molecole di piccola dimensione.

Il dispositivo

Il dispositivo è composto da una pila multistrato di tre sottosistemi:

• • uno strato adesivo dermocompatibile, con aperture microlavorate che definiscono le zone di raccolta del sudore;

• • un sistema di morbidi canali microfluidici e serbatoi, predisposti con reagenti per l’analisi chimica e per la rilevazione del volume di sudore raccolto;

• • un’antenna magnetica per NFC (“Comunicazione in prossimità”), che consente l’interfacciamento con dispositivi wireless esterni (Fig. 1).

La piattaforma di analisi del sudore che abbiamo sviluppato permetterà il monitoraggio della salute sul posto, senza la necessità di prelievi di sangue, e consentirà alle persone di collegarsi al dispositivo posto sulla pelle direttamente con il proprio smartphone, utilizzando un’elettronica integrata che non richiede l’utilizzo di batterie – sostiene Rogers.

Il dispositivo è inoltre avvolto da un film adesivo acrilico per uso medico, che assicura una forte e stabile adesione alla pelle (~5,7 N), prevenendo le irritazioni e garantendo la giusta compatibilità anche con regioni del corpo in presenza di peli o capelli o già in presenza di sudore.

Figura 2. (A) Rappresentazione schematica di un dispositivo di controllo microfluidico del sudore e immagine ingrandita del sistema integrato NFC (nel riquadro). (B) Illustrazione del dispositivo visto dall’alto, dal centro e da dietro. I colori di riferimento per l’elettronica NFC (bianco e nero) sono sul lato superiore. I canali microfluidici con reagenti colorimetrici di analisi (acqua, lattato, il cloruro, il glucosio e il pH) sono nel mezzo. La parte inferiore è costituita da uno strato uniforme di adesivo incollato alle superfici inferiori dei microcanali chiusi PDMS, con aperture che consento l’accesso al sudore e con insenature che si collegano a questi canali. (C) Viste trasversali dei tagli definiti dalle linee tratteggiate (a) e (b) come mostrato nell’illustrazione del lato superiore in (B). (D) Immagine ottica di un dispositivo montato sull’avambraccio.

La geometria sottile (25 µm) ed il basso modulo (~17 kPa) di questo cerotto garantiscono un comfort di lunga durata e vestibilità nel periodo di stress previsto durante la deformazione della pelle. Le aperture preposte alla raccolta del sudore hanno un diametro di 3 mm, corrispondente a circa 10 ghiandole sudoripare, e veicolano il sudore nella zona superiore di ingresso del sistema microfluidico (Fig. 2-B). La pressione che sostiene il flusso all’interno dei canali deriva dall’azione delle ghiandole sudoripare, assistita da effetti capillari nei microcanali e dai materiali incorporati in essi.

Il particolare layout di canali e serbatoi indipendenti impedisce qualsiasi interferenza con altri liquidi presenti nel corpo, rendendo affidabili i risultati delle analisi chimiche condotte al loro interno, e prevede inoltre un canale a serpentina orbicolare che circonda il perimetro esterno ed è collegato a ciascuno dei serbatoi a fori attraverso dei canali di guida, al fine di evitare eventi di contropressione, che potrebbero impedire il normale flusso del sudore all’interno dei canali. Questo canale perimetrale ricopre un ruolo importante in quanto, essendo predisposto con un reagente cromogenico reattivo all’acqua, consente una valutazione quantitativa del volume di sudore raccolto, basata sulla variazione cromatica indotta dal sudore in una certa porzione del canale.

Tutti i canali ed i punti di raccolta del sudore sono collegati ad un canale di uscita (larghezza 100 µm) che termina sul bordo superiore-laterale del dispositivo (Fig. 2 – B, C).

Figura 3. E) Messa a punto sperimentale del sistema con pori artificiali di sudore. (F) Immagini SEM della membrana poliimmide (PI) mimando le ghiandole sudoripare umane. (G) Dimostrazione del flusso di fluido idrodinamico attraverso il dispositivo microfluidico utilizzando il sistema di pori di sudore artificiale alla velocità di 5,5 µl/ora.

I materiali utilizzati per realizzare il sistema di canali microfluidici sono costituiti da varianti di PDMS, appositamente formulate per offrire caratteristiche fisiche attraenti, tra cui la trasparenza ottica, la biocompatibilità, la facilità di adattamento nei sistemi microfluidici ed una risposta meccanica favorevole (basso modulo, circa 145 kPa, elevata elasticità, fino a circa 200% di deformazione a rottura).

La tecnologia NFC

La tecnologia basata su NFC acquisisce le immagini prendendo come punti di riferimento dei segni a forma di croce posti sulla parte superiore del cerotto, mentre il software di analisi è in grado di leggere la temperatura tramite un sensore integrato.

I fotogrammi in figura 4-A mostrano che, quando uno smartphone viene avvicinato al dispositivo, viene acquisita l’immagine del dispositivo attraverso la tecnologia basata su NFC e si avvia automaticamente l’analisi colorimetrica, che fornisce i risultati in termini di componenti RGB.

Fig 4. (A) Immagini che mostrano il funzionamento dell’interfaccia NFC tra il dispositivo di monitoraggio del sudore ed uno smartphone, con cui viene lanciato il software per la cattura e l’analisi delle immagini. (B) Immagini del biosensore microfluidico epidermico prima (a sinistra) e dopo (a destra) l’iniezione di sudore artificiale. (C) Monitoraggio del volume di sudore con coordinate polari e la loro relazione con il volume totale di sudore catturato (nel riquadro).

Il processo di estrazione dei dati dall’analisi del sudore si articola in 3 fasi:

• Acquisizione delle immagini
  L’utente, regolando la posizione dello smartphone rispetto al cerotto, può selezionare la regione da sottoporre all’analisi colorimetrica, così da ottenere il risultato in termini di colore RGB, che, opportunamente elaborato, porterà alla valutazione quantitativa del marcatore analizzato in tale regione (cloruro, glucosio, lattato, pH).

• Correzione dei colori
  Si utilizzano dei riferimenti di colore (bianco e nero) per compensare le variazioni di luminosità nelle immagini, dovute alle particolari condizioni di luce durante l’acquisizione (luce diurna, ombra, e varie altre fonti di luce). In particolare, un punto bianco al centro del dispositivo e quattro croci nere distribuite in prossimità dei valori del centro sono utilizzati per determinare i valori RGB  minimo e massimo assoluti nell’immagine, assunti poi come livelli 0% e 100% per la rappresentazione RGB percentuale (Fig. 4-B). Le croci forniscono inoltre un importante riferimento per operazioni di rototraslazione delle immagini, utili per realizzare un’analisi accurata del volume di sudore raccolto nel canale a serpentina.

• Colorimetria digitale
  I colori espressi in rappresentazione RGB percentuale vengono elaborati per estrarre informazioni quantitative sulle concentrazioni degli analiti e sul volume di sudore raccolto, facendo uso di curve di calibrazione (Fig. 4D).
  La Fig. 4-C mostra la curva di calibrazione utilizzata per la determinazione del volume di sudore raccolto, che, attraverso una rappresentazione in coordinate polari (data la geometria circolare del dispositivo), relaziona il volume con l’angolo del fronte di riempimento nel canale a serpentina (bordo d’attacco del cambiamento di colore), consentendo in tal modo una valutazione quantitativa della perdita di sudore totale e, dunque, del tasso di sudore totale (definito proprio come la quantità di sudore perso nell’unità di tempo ed espresso generalmente in l/h come una portata volumetrica), sfruttando l’informazione sull’intervallo di tempo di esposizione del dispositivo alla regione di pelle in fase di sudorazione.
  Si può osservare come la caratteristica forma a serpentina del canale perimetrale si rifletta nelle pseudo-linearità della curva di calibrazione per il volume di sudore.

La sperimentazione

La prima sperimentazione ha coinvolto nove soggetti umani, che hanno indossato i dispositivi su due diverse zone del corpo (parte bassa della schiena e avambraccio; Figura. 5-B) durante l’attività su cicloergometri in condizioni ambientali controllate (temperatura di 38 °C, umidità del 50%). Su ognuna delle due zone sono state utilizzate due versioni di dispositivi (indicate nei risultati come “Small” e “Large”), differenti per dimensioni e dunque per capacità di raccolta del sudore, in modo da confrontarne le prestazioni.

Fig. 5 – Prove su soggetti umani, del dispositivo di monitoraggio del sudore, in un ambiente con temperatura ed umidità controllati (35 ° C a 50% di umidità relativa). (A) immagini di due modelli di dispositivi utilizzati per gli studi. Il colore marrone corrisponde allo strato adesivo sui lati posteriori del dispositivo, con piccole e grandi zone di raccolta (insenature).(B) vengono indicate le posizioni delle macchie di sudore sui soggetti (avambraccio e parte bassa della schiena).(C) Immagini di due diversi tipi di macchie di sudore (piccole e ampie zone di raccolta) applicate alla parte bassa della schiena e sull’avambraccio raccolte in diversi momenti nel corso dello studio.

Le prestazioni dei dispositivi sono state verificate, in situ, con procedure convenzionali, che prevedono la raccolta del sudore tramite tamponi assorbenti applicati sulla pelle, le analisi di laboratorio, come la spettrofotometria, e infine la determinazione del tasso di sudore regionale normalizzato per unità di superficie nel corso di 1 ora (Fig. 5-C e 6-D).

Le concentrazioni di ioni cloruro, ioni idronio (pH), glucosio e lattato, ottenute dall’analisi colorimetrica, hanno mostrato eccellenti accordi con i risultati delle analisi di laboratorio, a conferma dell’affidabilità del dispositivo.

Nonostante i tassi di esposizione siano risultati molto variabili tra i singoli soggetti, si è osservato che in generale quelli misurati sulla parte bassa della schiena risultavano essere tipicamente circa 2,3 volte superiori rispetto a quelli dell’avambraccio, in linea con i risultati ottenuti con tecniche convenzionali in laboratorio. I dispositivi con piccola area di raccolta hanno inoltre riportato percentuali RGB di poco superiori a quelle dei dispositivi con grande zone di raccolta, forse a causa di alterazioni di traspirazione, indotte dalla presenza fisica del dispositivo (Fig. 5-E).

Fig. 6 – (D) tasso di raccolta determinato nella parte inferiore della schiena e dall’avambraccio. Le barre rappresentano la media di n=8; le barre di errore sono rappresentate da SD. * P <0.05, due code t test. (E) Correlazione di tasso tra il sudore raccolto dal dispositivo ed il riferimento di assorbimento del tampone (n=7). (F) Marker nel sudore ottenuti dalla elaborazione di immagini dei dati dal dispositivo (ombreggiata) contro l’analisi di laboratorio del sudore raccolto con tampone (ombreggiate) (n=7). * P <0,05, a due code t test.

Per verificare l’integrità meccanica e fluidica del dispositivo in uno scenario di esercizio impegnativo, sono state testate la robustezza dell’adesione e l’efficacia della raccolta di fluido su alcuni volontari durante il Tour de Tucson, una gara ciclistica competitiva di lunga distanza che si svolge all’aperto. I partecipanti non hanno riportato alcun senso di disagio o di limitazione nei movimenti del corpo o del braccio durante la gara.

Fig. 7 – Confronto tra i risultati delle analisi del sudore condotte sui volontari del Tour de Tucson: si può notare come nei pazienti anziani (età 50 e 69 anni) il canale a serpentina sia per gran parte decolorato, evidenziando un maggior volume di sudore raccolto, rispetto a quello evidenziato dai risultati dei pazienti giovani di sesso maschile (dai 10 ai 29 anni), a sua volte maggiore di quello raccolto dai dispositivi dei pazienti giovani di sesso femminile.

Conclusioni

Il dispositivo microfluidico epidermico qui introdotto rappresenta una versatile piattaforma per la valutazione delle prestazioni atletiche e dello stato di salute, consentendo in determinati casi la diagnosi di alcune possibili malattie: ciò è possibile grazie a determinate proprietà meccaniche, a materiali costituenti biocompatibili, a risposte colorimetriche digitalmente analizzabili e, nel complesso, grazie ad un’attenta ottimizzazione della struttura.

Sfruttando in futuro concetti avanzati di analisi microfluidica dei sistemi e integrando le tecnologie di lab-on-a-chip conformi alle pelle, il team di Rogers sostiene la possibilità di implementare ulteriori modalità di utilizzo per il dispositivo.

Sistemi simili possono essere utilizzati, inoltre, come sistemi di raccolta passiva e stoccaggio di piccoli campioni (inferiori a circa 50 µl) di diversi biofluidi prodotti spontaneamente dal corpo, come lacrime, saliva, o sangue proveniente da ferite, ma anche come sistemi di raccolta attiva del sudore o di estrazione di altri fluidi (ad esempio, fluidi interstiziali) in combinazione con sistemi elettronici o con mezzi farmacologici.

In entrambe le modalità di raccolta, attiva e passiva, i dispositivi possono essere usati nell’atletica e nella formazione militare, al fine di valutare la perdita critica di elettroliti, per prevenire in modo efficace qualsiasi tipo di perdita o di mancanza fisiologica.

Il basso costo di questi dispositivi potrebbe facilitare una rapida e ampia distribuzione per un uso quotidiano: in questo scenario, i dati raccolti nel tempo dai singoli utenti potrebbero fornire una base per lo sviluppo di approcci analitici, volti all’individuazione di possibili segni (come per esempio lo stato di idratazione) associati a risposte anomale durante lo svolgimento di attività fisiche, o alla diagnosi di alcune malattie come, ad esempio, la fibrosi cistica.

Fonti ed approfondimenti:

• University of Illinois: http://rogers.matse.illinois.edu/files/2016/stmepiufl.pdf

• University of Arizona: https://uanews.arizona.edu/story/ua-researchers-go-distance-fluid-analysis-sweat

• Sciencemag: http://stm.sciencemag.org/content/8/366/366ra165

• Sciencedaily: https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161123142353.htm