Lo sviluppo di una rete di capillari che possa ossigenare il tessuto artificiale rappresenta una sfida ancora oggi aperta in campo biomedico, ma decisiva per l’avanzamento della ricerca su organi artificiali e tessuti ingegnerizzati. In questo contesto, un gruppo di ricerca della Carnegie Mellon University, in Pennsylvania, ha sviluppato una tecnica di stampa 3D che sfrutta il ghiaccio come bio-inchiostro per produrre microstrutture con geometrie complesse, come i vasi sanguigni.
Stampa 3D di ghiaccio: il potere dell’acqua
L’acqua è il solvente maggiormente diffuso in natura, nonché l’elemento principale di ogni forma di vita. E’ quindi stato considerato il suo utilizzo come biomateriale e, in particolare, per la realizzazione di strutture di ghiaccio sacrificali – ovvero utilizzabili a loro volta come stampi negativi del dispositivo finale. La stampa 3D si presta molto bene alla realizzazione di queste strutture, e infatti è impiegata sia a livello macroscopico (e.g., in ambito architettonico) che microscopico (e.g., microfluidica e biomimesi).
Grazie alle sue proprietà fisiche, l’utilizzo dell’acqua per questa applicazione comporta vantaggi dal punto di vista tecnico e funzionale. Infatti, la rapidità della transizione di fase dell’acqua a basse temperature è ottimale, in quanto permette di depositare il materiale ottenendo, quasi istantaneamente, una struttura dalla geometria complessa, solida e robusta. Ciò permette anche di evitare la stampa di una struttura di supporto. Inoltre, l’acqua è il materiale biocompatibile per eccellenza: pertanto, in seguito alla sua rimozione non si corre il rischio che vi siano residui di solventi o composti potenzialmente citotossici. Per di più, l’acqua ha un costo ridotto rispetto agli idrogeli e polimeri – materiali di comune utilizzo nella stampa 3D.
3D-ICE Printing: i limiti delle tecniche tradizionali
Nella maggior parte dei casi, per questa applicazione si ricorre alla tecnica della stampa a getto di inchiostro, che permette di depositare gocce micrometriche su un substrato appropriato. Tuttavia, in base a come viene scelto di depositare il ghiaccio si possono ottenere risultati differenti (Figura 1). Da circa dieci anni, sono stati infatti condotti diversi studi per ottimizzare il processo di stampa 3D del ghiaccio, ad esempio:
- Utilizzando un convenzionale approccio strato-su-strato, si riscontra una risoluzione inferiore (Figura 1a). Si ricorreva a una struttura di supporto per le geometrie complesse, che nella pratica limita il campo di applicazione.
- Depositando una goccia alla volta e aspettando che questa solidifichi prima di depositare la successiva, si ottengono si geometrie complesse ma con profili irregolari, inadatti a riprodurre la forma di un vaso sanguigno fisiologico (Figura 1b);
Stampa in forma libera: nuovo approccio alla stampa 3D del ghiaccio
Per ovviare a queste problematiche, è stata sviluppata una nuova tecnica di stampa in forma libera, anch’essa basata sulla stampa a getto di inchiostro (Figura 2). In questo caso, la deposizione di acqua è regolata variando l’ampiezza e la frequenza della forma d’onda con cui opera l’ugello piezoelettrico responsabile del rilascio delle goccioline di liquido.
- Negli approcci tradizionali, l’acqua – materiale di stampa – viene depositata secondo quantità e volumi discreti, definiti voxel.
- Con la stampa in forma libera, invece, le variazioni del diametro delle gocce che vengono rilasciate sono sincronizzate con il movimento del piano di stampa.
Nell’ultimo caso, anche la frequenza di rilascio delle gocce è ottimizzata per ottenere una stampa ottimale. Al di sotto di una certa frequenza, la goccia precedente si congela prima ancora che la successiva venga depositata, portando a stampe discontinue. Al contrario, a frequenze di lavoro maggiori, il deposito d’acqua che si forma sulla zona di stampa si congelerà nella direzione di accrescimento del costrutto ma più lentamente, permettendo di ottenere delle superfici lisce.
La risoluzione della stampante non dipende solamente dalla regolazione del movimento e dal rilascio dell’acqua, ma anche dal diametro dell’ugello. Nel lavoro, il team di ricerca ha testato diametri variabili fino ai 20 μm, oltre i quali si corre il rischio di nebulizzazione che può compromettere la stabilità della struttura.
Caratteristiche delle condizioni di lavoro
Per garantire una transizione di fase dell’acqua sufficientemente rapida da creare istantaneamente una struttura stabile, il piano di stampa è raffreddato fino ai -35 °C. Inoltre, per evitare eventuali contaminazioni e la deposizione di brina sulla struttura o sul piano di stampa, tutto il processo viene svolto all’interno di un involucro acrilico e sottoposto ad un flusso di azoto secco. Abbassando ulteriormente la temperatura di stampa si potrebbero ottenere più rapidamente strutture anche più grandi. Il congelamento degli strati superiori dipende, infatti, dalla conduzione di calore e, di conseguenza, maggiori sono le dimensioni della struttura e maggiore sarà il tempo necessario a garantire il congelamento del nuovo strato depositato. La regolazione del processo è abbastanza complessa, tuttavia permette delle superfici lisce e strutture visivamente omogenee, limitando anche i tempi di stampa (Figura 3). Il metodo di stampa ha permesso di ricreare la forma complessa di un vaso sanguigno avente ramificazioni e sezioni variabili.
Lo stampaggio inverso di micro-strutture complesse
Questa tecnica rappresenta un notevole passo avanti nello sviluppo di strutture sacrificali per la produzione di dispositivi tramite stampaggio inverso. In campo biomedico, le alternative attualmente esistenti includono l’utilizzo di polimeri biodegradabili, che quindi necessitano di un tempo maggiore per essere rimossi dallo stampo, oppure polimeri non biodegradabili che devono necessariamente essere rimossi mediante solventi organici che potrebbero accumularsi nel materiale stampato.
I tempi di reticolazione dei polimeri o degli idrogeli rallentano notevolmente il processo di stampa e soprattutto non permettono di ottenere geometrie complesse. Dal momento che le dimensioni di una cellula endoteliale sono di circa 15-20 μm di diametro, la risoluzione delle geometrie è fondamentale. Anche piccole imperfezioni possono determinare il fallimento di un esperimento, ad esempio inducendo sulle cellule coltivate stimoli meccanici indesiderati.
Stampaggio inverso su stampo biocompatibile
Durante lo studio, il gruppo di ricerca ha verificato l’efficacia delle strutture in ghiaccio per lo stampaggio inverso colando una resina (Figura 3c): a reticolazione avvenuta, il ghiaccio ha sublimato, lasciando nella resina solo la sagoma del vaso.
La possibilità di utilizzare queste strutture di ghiaccio per l’ingegneria dei tessuti ha spinto Feimo Yang, studente alla Carnegie Mellon University, a identificare possibili alternative biocompatibili da utilizzare per lo stampo. Ha quindi testato la gelatina metacrilata (GelMA) come materiale di supporto. Lo stampo negativo dei vasi è stato seminato con cellule endoteliali per verificare l’efficacia e la biocompatibilità del modello. Il lavoro del suo gruppo di ricerca è stato presentato lo scorso febbraio 2024 al 68° Convegno Annuale della Società di Biofisica.
Infatti, le proprietà dell’acqua, unite alla versatilità della stampante 3D rendono questo metodo molto interessante in termini di biocompatibilità e versatilità in molte applicazioni.
Conclusioni e sviluppi futuri
Questa tecnologia innovativa attrae i ricercatori da quasi un decennio e questo per via delle sue potenziali applicazioni nell’ambito della microfluidica e dell’ingegneria dei tessuti. Con questo tipo di strutture si potrebbero sviluppare sistemi di drug delivery, chip per l’analisi e la separazione delle cellule del sangue, o ancora array di microcapsule utilizzabili per diverse applicazioni. Inoltre è di particolare interesse per la ricerca l’utilizzo di questa tecnica per ottenere tessuti ingegnerizzati vascolarizzati, utilizzabili sia per lo sviluppo di modelli in vitro, che per costrutti impiantabili.
Fonti e approfondimenti:
- Advanced Science – Freeform 3D Ice Printing (3D-ICE) at the Micro Scale
- Nature – Inkjet printing-based fabrication of microscale 3D ice structures
- Science – 3D ice printing can create artificial blood vessels in engineered tissue
