In diversi studi si è cercato di riprodurre un tessuto che emulasse il cervello umano e fino ad oggi sono stati sviluppati dei metodi come quello della generazione di organoidi cerebrali (OC) e quello dell’utilizzo della microfluidica per simulare le condizioni di sviluppo di tale organo (brain-on-a-chip, BoC). Questi procedimenti rendono possibile sia studiare più nel dettaglio lo sviluppo di malattie e reazioni ai farmaci all’interno di questo organo sia, un giorno, utilizzare gli OC per la medicina rigenerativa.
Che cosa è un organoide?
Gli organoidi sono degli aggregati cellulari 3D disposti in una piastra – o fiasca – da laboratorio, che assumono spontaneamente una precisa conformazione, finendo per assomigliare a degli organi in miniatura. Questo rende possibile avere informazioni sulle interazioni tra più tessuti e sullo sviluppo di vari organi.
In questo modo è possibile studiare come gli organi vengono attaccati da alcune malattie e come rispondono a determinati farmaci, così da generare delle terapie mirate per ciascun paziente.
È possibile, infatti, generare degli organoidi da cellule estratte direttamente dal paziente e successivamente progettare e analizzare una eventuale cura. Così sarà possibile utilizzare questa tecnica nel contesto della medicina personalizzata. La medicina personalizzata prevede infatti che per il trattamento di una persona, oltre al quadro clinico, siano fornite informazioni sul corredo biologico (e.g., dati genetici).
La nuova frontiera degli organoidi del cervello umano
Gli organoidi del cervello umano sono tessuti tridimensionali generati in vitro da cellule staminali pluripotenti in grado di ricapitolare lo sviluppo iniziale del cervello umano. Tuttavia, tali organoidi non prevedono un sistema vascolare, che svolge ruoli indispensabili non solo nell’omeostasi cerebrale, ma anche nello sviluppo del cervello. Oltre a fornire ossigeno e nutrimenti (come zuccheri, sali minerali e vitamine), le evidenze scientifiche accumulate suggeriscono che il sistema vascolare del cervello regoli la differenziazione neurale, così come la migrazione e la formazione dei circuiti durante lo sviluppo (Figura 1).
Figura 1. Lo sviluppo del sistema vascolare e del sistema neuronale nell’embrione. Si osserva come i due sistemi si generino in parallelo e come la vascolarizzazione sia fondamentale. Inoltre, i vasi nel cervello in via di sviluppo inducono differenziazione neuronale, migrazione e formazione di rete, oltre alla loro ben noto ruolo nell’alimentazione delle cellule neurali. Questi risultati dimostrano l’importanza di un’appropriata vascolarizzazione nello sviluppo del cervello umano. Credits: Stem cells journals
Pertanto, la vascolarizzazione degli organoidi del cervello umano è di grande importanza. Le prove attuali per vascolarizzare i vari organoidi includono l’adeguamento dei protocolli di coltivazione, l’introduzione di dispositivi microfluidici e il trapianto di organoidi in topi immunodeficienti.
In particolare si è cercato di sviluppare organoidi della corteccia cerebrale: essi prendono il nome di organoidi corticali (OC) e sono formati dai neuroni, dalla glia e da fibre nervose senza mielina con uno spessore di circa 2–4 mm.
Come è stato possibile vascolarizzare gli organoidi?
Ad oggi sono diversi i metodi utilizzati per ottenere la vascolarizzazione degli organoidi corticali. Studi in vitro e studi in vivo sono stati affiancati anche da modelli organ-on-a-chip.
Organoidi corticali vascolarizzati in vitro
Un recente studio ha dimostrato il successo della vascolarizzazione di organoidi cerebrali umani di 34 giorni di età incorporandoli in Matrigel (Corning Matrigel) contenente cellule endoteliali ottenute da cellule umane staminali pluripotenti indotte (iPSC). Dopo 34 giorni di cocultura, sono stati osservati molti vasi penetranti negli organoidi cerebrali, i quali sono stati in grado di esprimere la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche, ovvero il cluster di differenziazione 31 (CD31).
In alternativa, nello studio di Shi e Yinghaoper la vascolarizzazione di OC è stata indotta tramite la cocoltura di cellule endoteliali vascolari ombelicali umane (HUVEC) e iPSC. Successivamente, gli OC sono stati analizzati nel dettaglio ed è stato osservato:
- Un miglioramento dello stato ipossico;
- Un aumento delle dimensioni degli organoidi rispetto alla controparte non vascolarizzata.
Un altro gruppo di ricercatori ha applicato la tecnologia di modifica del genoma per sviluppare organoidi cerebrali umani vascolarizzati. In questo studio, gli organoidi cerebrali sono stati indotti da cellule staminali embrionali umane (hESC) in alcune delle quali il gene ETV2, noto per convertire direttamente i fibroblasti in cellule endoteliali, era progettato per essere espresso in presenza di doxiciclina – un antibiotico derivante dalla tetraciclina (Figura 2).
Le caratteristiche sono molto simili fra cocoltura con HUVEC e quella con hESCs, sebbene in quest’ultimo caso si sia formato un sistema vascolare simile alla barriera ematoencefalica esprimendo alcuni marcatori tipici, come ZO-1 e occludina.
Figura 2. A sinistra oganoidi corticali non vascolarizzati e a destra organoidi corticali vascolarizzati con la sovra-trascrizione del fattore hETV2. Credits: Nature
Organoidi corticali vascolarizzati in vivo
In diversi studi gli organoidi sono stati poi impiantati all’interno di topi immunodepressi, per osservare la possibile integrazione fra sistema vascolare dell’ospite con il network generato in vitro (Figura 3).
In alcuni topi gravemente immunodeficienti è stato possibile “umanizzare” le loro popolazioni di ematociti mediante trapianto di cellule staminali ematopoietiche umane (HSC). Così all’interno del topo è stato possibile ospitare sia organoidi vascolarizzati umani che ematociti umani. Un tale modello murino sarebbe una piattaforma ideale per l’analisi dell’ischemia cerebrale umana e delle risposte successive.
Anche nello studio di Bilal Cakir pubblicato su Nature, dove era stato fatto esprimere il fattore hETV2, il trapianto in topi immunodepressi è avvenuto con esito positivo portando, anche in questo caso, alla connessione tra sistema vascolare generato in vitro e sistema vascolare murinico.
Brain-on-a-chip
Con “Organ-on-a-chip” si intende una piattaforma in cui si combinano l’ingegneria dei tessuti e la tecnologia microfluidica. L’introduzione della tecnologia microfluidica permette la simulazione delle caratteristiche fisiologiche dei tessuti in piattaforme ingegnerizzate in vitro.
La tecnica organ-on-a-chip può controllare il microambiente, compresa la distribuzione spaziale delle cellule, le proprietà meccaniche ed i gradienti di concentrazione biochimica. Gli organ-on-a-chip permettono di imitare le caratteristiche fisiologiche dei tessuti viventi in un ambiente ingegnerizzato (vengono utilizzati anche per lo studio del microambiente tumorale). Recentemente, oltre agli organoidi corticali è stato possibile sviluppare anche i brain-on-a-chip (BoC) (Figura 4).
A differenza degli OC, i BoC possono imitare in modo più robusto la struttura unidirezionale e le connessioni funzionali del circuito neurale. Nelle colture di neuroni convenzionali, i neuroni sono placcati su un substrato piatto 2D e quindi gli assoni dei neuroni crescono in direzioni casuali. E questo può rendere possibile lo studio dei singoli assoni. Inoltre, recentemente è stata anche sviluppata una varietà di BoC per simulare circuiti neurali in ambienti 3D.
In secondo luogo, i BoC possono imitare la struttura e la funzione della barriera ematoencefalica (BEE). La BEE nei BoC viene riprodotta tramite due canali separati da una membrana porosa, con cellule gliali ed endoteliali in coltura su entrambi i lati (superficie superiore e inferiore, rispettivamente) della membrana porosa stessa.
Generalmente, le piattaforme organ-on-a-chip sono realizzate in polidimetilsilossano (PDMS), un tipo di gomma siliconica trasparente. Strutture su scala micrometrica, come canali, pilastri e fori, possono essere formate nel blocco PDMS nei quali viene fatto fluire il sangue artificiale o il campione biologico, come ad esempio nel caso dei “point-of-care testing”.
Come utilizzare gli organoidi corticali in futuro
Oltre alla potenziale applicazione negli studi sull’ictus ischemico e sulla BEE, gli organoidi vascolarizzati potranno facilitare lo studio dell’interazione neuro-vascolare nella fase di sviluppo nell’uomo. Ad oggi gli eventi di sviluppo mediati dalle interazioni neurovascolari nel cervello rimangono quasi sconosciuti per la mancanza di un sistema di analisi su piattaforma umana. Utilizzando organoidi cerebrali vascolarizzati, i ricercatori potranno iniziare a studiare quindi le interazioni neurovascolari negli esseri umani.
Infine, la dimensione limitata degli organoidi è stata comunemente riconosciuta come un problema critico nella tecnologia degli organoidi. E’ stato però osservato che tramite la vascolarizzazione degli organoidi si riduce notevolmente l’apoptosi cellulare, e di conseguenza il problema delle dimensioni degli organoidi non risulta più critico. Potrebbe perciò essere utile istituire un protocollo per la vascolarizzazione di qualsiasi organoide.
Sebbene gli organoidi cerebrali non siano ancora stati utilizzati nella terapia rigenerativa dei cervelli danneggiati, la vascolarizzazione degli OC potrebbe essere utilizzare per tale tipo di terapia. Infatti, come è stato visto nei topi immunodeficienti, un’integrazione dell’organoide all’interno dell’organismo è oggi possibile e tale attecchimento è agevolato dalla vascolarizzazione dell’organoide stesso.
Bibliografia
- Stem Cells – Vascularization of human brain organoids
- Neuroreport – Generation of human vascularized brain organoids
- Plos Biology – Vascularized human cortical organoids (vOrganoids) model cortical development in vivo
- Nature – Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system
- Advanced Healthcare Materials – Emerging Brain-Pathophysiology-Mimetic Platforms for Studying Neurodegenerative Diseases: Brain Organoids and Brains-on-a-Chip
