Gli studi sul diabete vedono una carenza di modelli autentici in grado di replicare le condizioni patologiche delle isole pancreatiche umane. Ad oggi, gli “islet organoid” (ovvero gli organoidi ingegnerizzati che mimano le cosiddette isole di Langerhans) sembrano essere un ottimo modello per lo studio di questa patologia. Inoltre, in futuro potrebbero essere utilizzati anche come piattaforme per lo screening di farmaci, la sostituzione di tessuti e la terapia personalizzata.
Pancreas, diabete e organoidi: dall’organo al laboratorio
Il pancreas e l’isolotto pancreatico
Il pancreas (costituito dalle isole di Langerhans, che formano l’isolotto pancreatico) è un organo endocrino essenziale per secernere ormoni volti al mantenimento dell’omeostasi della glicemia. Esso comprende 5 tipi di cellule differenti:
- cellule β, produttrici dell’insulina;
- cellule α, produttrici di glucagone;
- cellule δ, produttrici di somatostatina;
- cellule γ, che producono il polipeptide (PPY) gamma/PP;
- cellule ε, che producono grelina.
Le isole sono strettamente coinvolte nello sviluppo del diabete, pertanto lo sviluppo di questi organoidi può essere un’ottima piattaforma per lo studio di questa malattia.
Il diabete
Il diabete è un gruppo di malattie caratterizzate da alti livelli di glucosio nel sangue, causati da difetti nella generazione e nell’utilizzo di insulina del corpo umano. L’insulina, un ormone che viene sintetizzato dal pancreas, regola il livello di glucosio nel sangue, riducendo così la glicemia.
Tra le patologie diabetiche più comuni troviamo:
- diabete mellito – caratterizzato da iperglicemia (malattia metabolica), colpisce più di 400 milioni di persone e può portare a morte prematura. La causa di tale malattia risiede in un malfunzionamento della secrezione dell’insulina da parte delle cellule β, ma anche nella mancata risposta da parte delle cellule all’insulina, non innescando così il consumo di glucosio.
- diabete di tipo 1 (T1D) – una malattia autoimmune che causa disfunzione cellulare. La patologia è causata dalla generazioni di autoanticorpi che attaccano le cellule β del pancreas responsabili della secrezione di insulina. Ciò porta a un’alterazione notevole di livelli di glucosio nel sangue arrivando a livelli gravi di iperglicemia.
- diabete di tipo 2 (T2D) – il più comune tra gli adulti; caratterizzato da una secrezione di insulina insufficiente e causato da fattori ereditari e ambientali che generano un deficit di insulina nell’organismo. E’ stata dimostrata l’esistenza di un fattore di trasmissione ereditario che accomuna alcune popolazioni o famiglie, ma non è ancora stato accuratamente identificato.
Tutt’ora sia la genesi della malattia che i regimi terapeutici sono ancora poco chiari e necessitano di approfondimento scientifico. A tal scopo, gli organoidi pancreatici possono venire in aiuto per risolvere i problemi precedentemente citati.
Cosa sono gli organoidi
Gli organoidi sono degli aggregati cellulari 3D generati in laboratorio. Essi possono essere definiti come organi in miniatura. Grazie a questa tecnica è possibile affrontare in modo più approfondito lo studio di patologie come il diabete o come l’ictus, tramite, rispettivamente, organoidi insulari (islet organoid) e organoidi corticali. Questi “organi in miniatura” promettono di avere anche un ruolo molto importante nella medicina rigenerativa.
Organoidi pancreatici: strategie e modelli di generazione
Recentemente sono stati progettati diversi modelli per la generazione di cellule beta e organoidi insulari in vitro. In Figura 1 sono riportate le vie di segnalazione per lo sviluppo in cellule sc-β (stem cell-derived β) da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), sequenzialmente differenziate in endoderma definitivo (DE), progenitori pancreatici (PP), precursori endocrini (EP) e cellule endocrine (EC), che mostrano i marcatori cellulari (i.e., un insieme di proteine specifiche che caratterizzano ogni tipologia di cellula in modo tale da renderne possibile l’identificazione, la classificazione e la visualizzazione). Tramite i marcatori è possibile eseguire in modo preciso ed efficace i protocolli necessari per la formazione degli organoidi pancreatici.
I percorsi chimici in vitro utilizzati per la sequenza di specializzazione delle cellule staminali in cellule β cercano di ricreare il microambiente di sviluppo che tali cellule avrebbero in vivo, all’interno di un organismo umano. Durante il processo di specializzazione, le hPSC vengono fatte sviluppare in cellule dell’endoderma, uno dei foglietti embrionali (assieme ad ectoderma e mesoderma) costituiti da cellule staminali pluripotenti dai quali si sviluppa l’organismo. Da qui si sviluppa la maggior parte degli organi viscerali (fegato, pancreas, apparato digerente ed anche apparato respiratorio).
Strategie per la fabbricazione di organoidi 3D
Oltre ai protocolli chimici per la differenziazione delle cellule staminali in sc-β, è stato ampiamente indagato anche il ruolo del microambiente 3D per lo sviluppo delle isole in vitro. Infatti, le isole sono dense architetture 3D con modelli di distribuzione cellulare specifici, in cui le interazioni cellula-cellula hanno ruoli significativi nella regolazione delle specifiche del destino cellulare e della funzione delle isole.
Colture 3D basate sulla sospensione cellulare
La capacità di auto-organizzazione delle hPSC è stata ampiamente impiegata per aggregare le hPSC dissociate in corpi embrionali 3D (EB) con diametri variabili dipendenti dal sistema di coltura.
Ad esempio, è possibile utilizzare piastre di agitazione per applicare una rotazione costante alle hPSC e facilitare la generazione di strutture 3D. Morfologicamente e funzionalmente gli ammassi ottenuti attraverso questa tecnica assomigliano a isolette umane autoctone. Tuttavia, sono state rilevate poche cellule endocrine non di tipo β rispetto a quelle nelle isole umane (Pagliuca et al., 2014).
Possono essere utilizzati anche dispositivi microfluidici per una strategia più sofisticata. Questa tecnica sfrutta un elevato controllo e manipolazione di fluidi, che vengono indotti in geometrie di piccole dimensioni inferiori al diametro di 100 µm. Con l’utilizzo di questo metodo sono stati generati organoidi con una maggior vitalità cellulare ed una funzione delle isole significativamente migliorata (Tao et al., 2019).
Infine, nelle cellule sc-β, è stato osservato che i meccanismi metabolici alla base della maturazione delle cellule β sono facilitati dal clustering in 3D. Inoltre le tecniche in 3D favoriscono anche la respirazione ossidativa mitocondriale rispetto ai metodi in 2D (Nair et al., 2019).
Colture 3D basate su scaffold
Invece di fare affidamento sull’auto-organizzazione delle cellule per stabilire strutture 3D, altre strategie hanno utilizzato componenti della matrice extracellulare (ECM) o scaffold. Con queste tecniche viene creata artificialmente una struttura per promuovere la formazione degli organoidi 3D, creata in vitro oppure direttamente dal tessuto di interesse, decellularizzandolo per poi utilizzarne solo la ECM. Un esempio è dato dall’utilizzo di un’impalcatura che combina collagene e Matrigel (Wang et al., 2017).
In alternativa si può utilizzare un pancreas decellularizzato come impalcatura. Questa si è rivelata essere una strategia efficace per fornire un microambiente biomimetico intatto, a supporto della differenziazione e della maturazione delle cellule sc-β. (Wan et al., 2017).
Strategie per la maturazione degli organoidi
Oltre all’utilizzo di protocolli per l’induzione cellulare e a strutture 3D, sono stati sviluppati anche dei metodi per facilitare la maturazione e lo sviluppo degli organoidi.
Organoidi pancreatici vascolarizzati in vivo
La maturazione in vivo degli organoidi derivanti dalle hPSC genera complessi molto simili alle isole native. Rimangono comunque delle differenze: la rete vascolare, caratteristica molto importante nel pancreas per l’elevata attività endocrina, non viene adeguatamente sviluppata in vitro. Per superare questo limite, alcuni gruppi di ricerca hanno pertanto indagato diverse tecniche di crescita di organoidi in vivo al fine di favorire la vascolarizzazione.
Un recente studio ha rivelato che la co-coltura di linee cellulari, frammenti di tessuto nativo e sferoidi iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte) con cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e cellule staminali mesenchimali (MSC) in Matrigel ha consentito la formazione di organoidi delle isole vascolarizzate (Takahashi et al., 2018a; Takahashi et al., 2018b). In un altro studio è stato stabilito un letto vascolare-induttivo funzionalizzando l’idrogel bioattivo polietilenglicole (PEG) con il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA), per promuovere la formazione e l’espansione del sistema vascolare (Phelps et al., 2013).
Possibili applicazioni
La combinazione di tecnologie di editing genetico come CRISPR/Cas9 e la raffinata tecnologia basata su iPSC consentono di manipolare gli organoidi pancreatici per studiare i meccanismi evolutivi, funzionali e patologici delle isole umane normali e diabetiche. Consentono, inoltre lo sviluppo di piattaforme di screening di farmaci e terapie personalizzate (Figura 3).
Gli organoidi delle isole, derivati da hESC o iPSC riprogrammate da individui sani, sono in grado di fungere da nuovo sistema modello per lo sviluppo delle isole umane e la ricerca funzionale. Invece le iPSC derivate da pazienti non sani possono essere utilizzate per generare organoidi delle isole funzionali con o senza correzione del malfunzionamento, fornendo così da una parte una fonte illimitata di isole per il trapianto autologo per la medicina autorigenerativa e, dall’altra, una piattaforma per lo studio della patologia dell’individuo.
Bibliografia
- Zhang, Xiaofei, et al. ” Islet organoid as a promising model for diabetes. ” Protein & Cell (2021): 1-19.
- Wang, Weiwei, Sha Jin, and Kaiming Ye. “Development of islet organoids from H9 human embryonic stem cells in biomimetic 3D scaffolds.” Stem cells and development 26.6 (2017): 394-404.
- Nair, Gopika G., et al. “Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells.” Nature cell biology 21.2 (2019): 263-274.
- Tao, Tingting, et al. “Engineering human islet organoids from iPSCs using an organ-on-chip platform.” Lab on a Chip 19.6 (2019): 948-958.
- Pagliuca, Felicia W., et al. “Generation of functional human pancreatic β cells in vitro.” Cell 159.2 (2014): 428-439
- Takahashi, Yoshinobu, et al. “Self-condensation culture enables vascularization of tissue fragments for efficient therapeutic transplantation.” Cell reports 23.6 (2018): 1620-1629.
- Takahashi, Yoshinobu, Takanori Takebe, and Hideki Taniguchi. “Methods for generating vascularized islet‐like organoids via self‐condensation.” Current protocols in stem cell biology 45.1 (2018): e49.
- Phelps, Edward A., et al. “Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes.” Biomaterials 34.19 (2013): 4602-4611.
- Immagine di copertina : Lotta Hof, Goethe University Frankfurt
