L’ottenimento di un modello ingegnerizzato che possa replicare la conformazione e le funzionalità, sia fisiologiche che patologiche, del cervello umano è stato a lungo una grande sfida per la ricerca scientifica. Un gruppo di ricercatori dell’Università del Wisconsin-Madison ha raggiunto un interessante traguardo mediante la biostampa 3D: un tessuto nervoso cerebrale straordinariamente funzionale sia nella sua morfologia stratificata che nella sua attività di comunicazione sinaptica è stato riprodotto in laboratorio, assicurando al contempo il mantenimento della sua struttura tridimensionale.
Il design del tessuto cerebrale per la biostampa 3D
I neuroni sono le cellule principali del sistema nervoso centrale. Essi comunicano con cellule target dando vita ad una rete funzionale talmente peculiare, che risulta estremamente complessa da replicare in vitro. Per tale scopo, è necessario ricercare un modello che possa riprodurre il tessuto nervoso umano quanto più fedelmente possibile, tale da poterne studiare il suo funzionamento, sia fisiologico che patologico.
Ad oggi sono state utilizzate molteplici tecniche di ingegnerizzazione per replicare l’architettura tridimensionale del tessuto nervoso cerebrale umano. Partendo da cellule progenitrici neurali derivate da cellule staminali pluripotenti (hPSCs) indotte (iPSCs) o staminali embrionali umane (hEPCs), si possono sfruttare diverse condizioni spaziali di coltura, come ad esempio su hydrogel, su vetrino bidimensionale, o in sistemi 3D come scaffold oppure organoidi. In altri casi, si associano anche tecniche come il metodo di sospensione acustica o la coltura in bioreattore (e.g., cervello-on-chip). Tuttavia, la maggiore precisione nella realizzazione è assicurata dalla biostampa 3D, grazie a cui un gruppo di studiosi dell’Università del Wisconsin-Madison è riuscito ad ottenere il primo modello funzionale di un tessuto cerebrale umano.
Questo potrebbe essere un modello di forte impatto per comprendere come le cellule e le parti del cervello comunicano tra di essi negli esseri umani.
Su-Chun Zhang, Professore di neuroscienze e neurologia, autore dello studio
Tecnica di biostampa 3D
Tale ricerca prevede un processo di biostampa 3D eseguito tramite la tecnica di estrusione, una sottocategoria della biostampa 3D insieme alle stampanti a getto di inchiostro e a quelle laser-assistite (Figura 1). In questo processo il “bioink” viene spinto attraverso un ugello e si deposita, strato dopo strato, in maniera orizzontale dando vita ad una struttura capace di replicare quella del tessuto cerebrale. Il “bioink” è composto da cellule staminali pluripotenti, che si possono differenziare in cellule progenitrici neurali, e gel di fibrina, a sua volta composto da una proteina (fibrinogeno) e un enzima e (trombina). Il gel di fibrina è fortemente biocompatibile con le cellule nervose, assicurando sia una corretta sopravvivenza cellulare che una maturazione funzionale delle cellule nervose.
L’obiettivo fondamentale dei ricercatori è stato quello di garantire la formazione e la maturazione delle connessioni sinaptiche non solo all’interno di ciascuno strato di bioink, ma anche tra gli stessi, al fine di ottenere una rete nervosa performante e un mantenimento stabile della struttura tridimensionale del gel.
Proprietà della struttura 3D
Una volta scelta la tecnica, sono stati investigati diversi aspetti biologici tra cui la vitalità cellulare, il corretto apporto di ossigeno e nutrienti, e in particolare:
- La composizione e la rigidezza del gel – una delle proprietà richieste dall’inchiostro speciale, detto “bioink”, è la capacità di supportare la sopravvivenza delle cellule stampate e promuoverne la maturazione. In questo lavoro è stato scelto il gel di fibrina, perché altamente biocompatibile con le cellule nervose, ottenuto dalla combinazione di fibrinogeno (2.5 mg/ml) e trombina (0.5 U): le concentrazioni sono bilanciate per mantenere la vitalità cellulare e assicurare tempi di gelificazione bassi (dell’ordine dei secondi: 145 ± 10 s). Difatti, un valore elevato di fibrinogeno permette l’aggregazione cellulare, mentre un valore basso di trombina favorisce la vitalità cellulare.
- La rigidezza del gel – che deve garantire il mantenimento della struttura 3D e la crescita dei neuriti (i.e., prolungamenti citoplasmatici della cellula nervosa, tra cui assone e dendriti) per la corretta comunicazione tra le cellule nervose. Per la stampa è stato aggiunto anche l’acido ialuronico, per ridurre la viscosità del gel di fibrina (Figura 2).
- Lo spessore del tessuto stampato – che potrebbe inficiare il corretto apporto di ossigeno e nutrienti alle cellule in esso contenute. In assenza di un sistema vascolare, la scelta dello spessore è limitata ad un range di 100-200 μm. Per una facile analisi, sia funzionale che morfologica, la scelta è ricaduta su uno spessore di 50 μm per ciascuno strato.
Le cellule biostampate modellano il circuito neurale
La struttura è ottenuta depositando le bande orizzontalmente e non verticalmente, come viene tipicamente eseguito con tale tecnica. Alla deposizione di ogni strato si aggiunge l’agente reticolante, cioè la trombina, sia per ottenere la forma desiderata che per evitare la fusione dei singoli strati. Per meglio osservare la struttura e la crescita del tessuto stampato, le cellule nervose progenitrici sono state identificate con due marcatori fluorescenti (GFP e mCherry) e osservate al microscopio a fluorescenza (Figura 3). In questo modo è stato osservato che le cellule progenitrici nervose maturano in maniera efficiente all’interno del proprio strato, formando una connessione neurale anche tra gli strati stessi.
Il tessuto biostampato 3D in condizione fisiologica
Entrando più nel dettaglio dello studio, i ricercatori hanno valutato la formazione di connessioni sinaptiche tra gli interneuroni GABAergici e i neuroni glutammatergici quando incorporati nel gel stampato. L’incorporazione di sottotipi di cellule nervose nelle tecniche fino ad ora implementate è considerata di difficile applicazione, ragione dell’innovazione di questa ricerca. Pertanto, è stata attuata la medesima metodica di stampa con un rapporto di 1:4 per le popolazioni progenitrici dei due tipi cellulari (il rapporto riflette quello presente nella corteccia cerebrale).
È stato osservato come non solo tali neuroni riescano a maturare e a mantenersi nel tempo all’interno del costrutto tessutale, ma anche come la presenza di entrambi favorisca la genesi delle sinapsi. Inoltre un risultato importante ha visto la formazione di sinapsi già dal giorno 20 dall’estrusione, riscontrato grazie alla rilevazione dell’espressione di due marcatori sinaptici (SYN1 e PSD95). Infine, la densità di tali punti sinaptici è aumentata con l’avanzare del tempo di coltura (Figura 4).
Un’ulteriore scoperta rispetto ai tessuti neurali fino ad ora stampati in 3D è l’ottenimento di una rete neurale funzionale: è stata qui dimostrata la capacità delle cellule nervose di evocare potenziali di azione. È stata eseguita la registrazione elettrofisiologica mediante la tecnica del patch-clamping sulla struttura con i progenitori corticali glutammatergici (colorati) e GABAergici (non colorati), come riportato in Figura 5. Per i primi sono state osservate correnti di sodio (Na) verso l’interno e di potassio (K) verso l’esterno, mostrando di poter evocare potenziali di azione già dopo 3 settimane dalla stampa.
Sono stati misurati anche i potenziali di azione spontanei che aumentavano nel tempo con la compresenza dei neuroni GABAergici, sottolineando ancora una volta una connessione funzionale e la creazione di una rete di trasmissione di segnali elettrici (Figura 6).
Il tessuto in condizione patologica
In ultima analisi, il costrutto 3D ottenuto mediante biostampa 3D è stato testato nella riproduzione di un tessuto cerebrale patologico. I ricercatori hanno valutato la risposta del tessuto sotto la “Malattia di Alexander” (AxD), una patologia neurodegenerativa, rara e genetica, causata principalmente da una mutazione del gene GFAP. Tale gene codifica per la proteina GFAP rilevante per il mantenimento strutturale delle cellule gliali nel sistema nervoso centrale. Difatti, alla mutazione è associata una perdita progressiva della sostanza bianca che compromette drasticamente la trasmissione del segnale nervoso. Anche in questa applicazione, il costrutto tessutale ha risposto in maniera coerente rispetto alla condizione patologica: infatti, una volta ottenuto il modello, è stato osservato come a 20 giorni dalla stampa i tessuti con AxD presentino espressioni molto più basse del gene GFAP rispetto al tessuto di controllo, oltre che una densità di punti sinaptici decisamente più ridotta – indicativo di una minore propensione alla genesi di collegamenti sinaptici – (Figura 7).
- Abbiamo parlato di biostampa 3D anche nei seguenti articoli:
Medicina rigenerativa e biostampa 3D: la ricerca ha bisogno di ingegneri biomedici
Novameat, la stampa 3D approda nel campo alimentare con la bistecca vegetale
Conclusioni
La ricerca condotta all’Università del Wisconsin-Madison potrebbe essere considerata una svolta per i modelli tridimensionali di tessuto nervoso umano. Lo studio ha permesso di portare alla luce come la tecnica di biostampa 3D abbia favorito la realizzazione di un costrutto in grado di mantenersi stabile e di portare alla maturazione cellulare fino alla funzionalità sinaptica. Tale scoperta supera di gran lunga quelle fino ad ora implementate perché diventa possibile incorporare diversi sottotipi neuronali, assicurando la loro maturazione e i collegamenti sinaptici, e studiare così i circuiti nervosi di diverse regioni cerebrali. Si comprende bene come tale ricerca sia la base per approfondire nuovi modelli di riferimento nell’ottica di ottenere tessuti via via più versatili e funzionali con flessibilità scegliendo le composizioni, l’orientamento cellulare e le dimensioni.
Fonti e Approfondimenti
- Cell Stem Cell – 3D bioprinting of human neural tissues with functional connectivity
- University of Wisconsin-Madison News – UW–Madison researchers first to 3D-print functional human brain tissue
- Science Daily – Researchers 3D-print functional human brain tissue
- Wired – Il primo modello di cervello umano funzionante stampato in 3D
